【有机】JACS：多肽Paenilamicins的全合成及生物活性研究

导读：

最近，德国柏林大学Roderich D. Süssmuth课题组首次实现多肽类化合物Paenilamicin B2（PamB2）的高效汇聚式全合成，并结合核磁分析和生物活性研究修正确定了其化学立体构型。生物活性研究显示，PamB2的Aga片段中C6位氨基立体中心决定其抗真菌活性，Aga片段是潜在的药效团。最后，结合相关生物活性研究数据，作者认为Paenilamicins类次级代谢物是一种潜在的核糖体抑制剂。相关研究成果发表在近期的《美国化学会志》上（J. Am. Chem. Soc. DOI: 10.1021/jacs.1c09616）。

背景介绍和逆合成分析（Figures 1, 2）：

（Figure 1，来源：J. Am. Chem. Soc.）

研究昆虫病原细菌产生的次级代谢物有助于：1）鉴定新的生物活性化学结构；2）从生态学和进化论角度阐明细菌防御机制。利用化学方法合成次级代谢物在确定化学结构和提供原料进行生物学研究方面都具有重要价值。Paenilamicins是从幼虫芽孢杆菌（Paenibacillus larvae）中分离出的一类抗细菌和抗真菌次级代谢物。结构分析显示，Paenilamicins A1, A2, B1, B2是一类线性阳离子聚酮-肽杂化物（Figure 1A-1C），具有和Galantin I（Figure 1D）类似的化学结构。1992年，Ohfune组实现了Galantin I的全合成，但产率低、路线冗长，导致无法大规模制备，未能研究其生物活性。最近，德国柏林大学Roderich D. Süssmuth课题组首次实现PamB2和其两个异构体的高效合成，并开展了结构-生物活性关系研究。

（Figure 2，来源：J. Am. Chem. Soc.）

PamB2的逆合成分析如Figure 2所示，主要策略就是通过酰胺化将一系列氨基酸片段偶联，包括左半部分片段（LHS）的四个小片段Aga、D-Ala、mDap、D-Orn和右半部分片段（RHS）的四个小片段Gla、mDap、Gly、Spd。其中合成难点在于找出Aga、Gla、Spd、mDap这四个氨基酸片段合成的最优路线。

Spd、mDap、Gla、Aga四个片段的合成（Schemes 1-4）：

（Scheme 1，来源：J. Am. Chem. Soc.）

Spd片段的合成难点在于选择性上氨基保护基。如Scheme 1所示，作者以丁二胺1为起始原料，通过对Cbz和Ns氨基保护基的巧妙应用，以6步大于50%的产率得到Spd片段4。

（Scheme 2，来源：J. Am. Chem. Soc.）

mDap片段的合成如Scheme 2所示，作者以Cbz-L-Asn-OH 5为起始原料，其通过Hoffmann重排反应转化成化合物6。6再通过上保护基和脱保护基等一系列转化最终实现mDap片段8的合成。

（Scheme 3，来源：J. Am. Chem. Soc.）

Gla片段是Paenilamicins全合成中最难合成的两个片段之一。如Scheme 3所示，作者以L-丝氨酸甲酯盐酸盐9为起始原料，经四步转化合成醛11。11通过关键的aldol反应以4:1的d.r.值转化成12。12再通过Narasaka-Prasad型同面还原-丙酮叉保护-皂化反应三步转化，经色谱柱纯化最终得到理想产物(3S,5R,6S)-14（36.9%）和其异构体(3R,5S,6S)-15（5.8%）。

（Scheme 4，来源：J. Am. Chem. Soc.）

Aga片段的合成是Paenilamicins全合成中另一个难点。如Scheme 4所示，作者以市售的N-Boc-L-Orn(Cbz)-OH 16为起始原料，先和麦氏酸反应，再经加热脱羧和还原得到化合物17。17通过氰化钾增碳-丙酮叉保护-脱Cbz-和吡唑衍生物20反应得到化合物21。21经还原-氧化-Wittig反应转化成化合物22。22经Sharpless不对称双羟基化-丙酮叉保护-皂化反应转化成最终片段Aga 25。

PamB2_1、PamB2_2、PamB2_3的合成和核磁分析（Schemes 5-7, Table S1, Figures S1-S3）：

（Scheme 5，来源：J. Am. Chem. Soc.）

在得到所需合成片段后，作者开展RHS、LHS片段的合成以及PamB2_1的合成，并和天然分离的PamB2进行核磁对比。如Scheme 5所示，经过一系列酰胺化偶联以及脱保护基、皂化反应等常规转化，得到RHS片段化合物30、LHS片段34。30和34经过酰胺化偶联和三氟乙酸脱Boc保护基得到化合物PamB2_1。核磁氢谱、碳谱和HSQC对比分析显示合成的PamB2_1化合物和天然分离的化合物PamB2在Aga和Gla片段部分有较大差异（FiguresS1-S2，Table S1 in SI），可能是因为Aga 25和Gla14片段上的相关立体构型和PamB2不符。作者认为Gla片段三个立体中心可能有着和Galantin I类似的(3S,5S,6S)构型。为了证明这一论断，作者利用Campagne课题组的方法合成了(3S,5S,6S)-Gla 40（Scheme 6）。然后利用Scheme 5类似的策略合成化合物PamB2_2。核磁分析显示PamB2_2的Gla片段部分核磁位移和PamB2一致（Table S1），这证明了作者的论断。HSQC分析显示Aga片段部分核磁位移显示，C6位立体构型差异较大，因此作者认为Aga片段立体构型可能为(2R,3S,5S,6R)。为此，作者采用如Scheme 7所示的合成路线合成了(2R,3S,5S,6R)-Aga 49，再利用Scheme 5类似的策略合成化合物PamB2_3。相关核磁分析结果显示PamB2_3和天然分离的PamB2一致（Table S1）。总之，作者利用化学全合成，结合一维和二维核磁分析，纠正了组内2014年报道的Paenilamicins化合物立体构型。

‍（Table S1 in SI，来源：J. Am. Chem. Soc.）

（Figure S1 in SI，来源：J. Am. Chem. Soc.）

（Figure S2 in SI，来源：J. Am. Chem. Soc.）

（Scheme 6，来源：J. Am. Chem. Soc.）

（Scheme 7，来源：J. Am. Chem. Soc.）

Paenilamicins的生物活性对比研究（Table 1, Figures 3-4）：

（Table 1，来源：J. Am. Chem. Soc.）

为了进一步确定合成的PamB2立体结构是否正确，作者开展了最为关键的生物活性对比分析研究。Table 1汇总了合成的PamB2_1、PamB2_2、PamB2_3和天然分离的PamB2以及环丙沙星（Ciprofloxacin）、两性霉素B（Amphotericin B）在抗细菌和抗真菌方面的生物活性检测数据。数据分析显示：1）所有合成的PamB2对革兰氏阳性菌（B. subtilis、S. aureus）都有抑制效果；2）在对真菌病原体Sp. Salmonicolor和A. fumigatus的活性抑制方面，只有合成的PamB2_3具有和天然分离的PamB2相同的抑制效果，这证明了PamB2_3立体结构的正确性。

（Figure 3，来源：J. Am. Chem. Soc.）

作者同时开展了合成的PamB2_2、PamB2_3和自然分离的PamB2在蜜蜂幼虫肠道环境中抑制苏云金芽孢杆菌（Bacillus thuringiensis, Bt）的生物活性研究（Figure 3）。在精密设计的幼虫喂食实验中：1）自然分离的PamB2和合成的PamB2_2、PamB2_3单独使用都不会提高蜜蜂幼虫的死亡率，证明三个化合物对蜜蜂幼虫无毒性；2）单独给蜜蜂幼虫喂食Bt孢子会明显提高死亡率；3）将自然分离的PamB2、合成的PamB2_2、PamB2_3和Bt孢子混合投喂蜜蜂幼虫，则会显著降低死亡率，从而证明Paenilamicins对Bt的抗菌活性。结合这些实验，作者推断PamB2_3的Aga片段C6位构型可能决定着该化合物的抗真菌活性，Aga片段是Paenilamicins潜在的药效团。为此，作者进一步开展了体外翻译抑制活性实验。实验结果如Figure 4所示，C6位氨基乙酰化后的化合物的抑制活性相比PamB2_3显著降低，从而证明了作者的论断。

（Figure 4，来源：J. Am. Chem. Soc.）

总结：

总之，Süssmuth课题组利用化学方法实现多肽类化合物Paenilamicin B2和两个异构体的全合成。通过开展生物活性对比研究，初步确定了其结构-生物活性关系。利用该合成路线，作者制备了足够的Paenilamicins，为进一步研究自我抵制机制在美洲幼虫腐臭病中的作用和这类潜在核糖体抑制剂的作用机制奠定了基础。

论文信息：

Total Synthesis and Biological Evaluation of Paenilamicins from the Honey Bee Pathogen Paenibacillus larvae

Timur Bulatov, Sebastian Gensel, Andi Mainz, Tam Dang, Timm O. Koller, Kerstin Voigt, Julia Ebeling, Daniel N. Wilson, Elke Genersch, and Roderich D. Süssmuth*

J. Am. Chem. Soc. DOI:10.1021/jacs.1c09616

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